Р. Т. Маннапова

Микробиология, микология и основы иммунологии

Учебник

---

ebooks@prospekt.org

Информация о книге

УДК [579+577.27](076.5)

ББК 28.4я73+28.074я73

М23

В оформлении обложки использованы изображения из архива автора

Автор:

Маннапова Р. Т., доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии и иммунологии Российского государственного аграрного университета – Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

Рецензенты:

Андреева А. В., доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой инфекционных болезней, зоогигиены и ветсанэкспертизы Башкирского государственного аграрного университета;

Дюльгер Г. П., доктор ветеринарных наук, доцент, заведующий кафедрой ветеринарной медицины Российского государственного аграрного университета – Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

Учебник состоит из восьми разделов. В нем изложены методы морфологических, физиологических исследований микроорганизмов, серологических, иммунологических и молекулярных методов диагностики. Книга содержит подробный материал о возбудителях особо опасных инфекционных болезней, микозов и кормовых микотоксикозов. Разделы составлены и изложены по единому плану. По каждой теме представлена теория вопроса, описаны материалы и оборудование, методика выполнения. Даны задания для самостоятельной работы и вопросы для контроля знаний. Ко всем инфекционным болезням, микозам и микотоксикозам в разделе 8 приведены схемы лабораторной диагностики и специфической профилактики. Представлен раздел микробиологии продуктов животного происхождения и кормов, в котором описаны вопросы их микробиологической контаминации и анализа. В разделе санитарной микробиологии предложены методы бактериологического исследования воды, почвы и воздуха. В учебнике дана подробная характеристика вопросам превращения микроорганизмами соединений углерода и азота. В конце книги приведен терминологический словарь, сведения об основоположниках микробиологии и иммунологии и лауреатах Нобелевской премии.

Предназначен для подготовки специалистов с учетом требований программы ФГОС ВО по направлению 36.05.01 «Ветеринария», а также магистров и бакалавров по направлению 36.04.01/36.03.01 «Ветеринарно-санитарная экспертиза».

УДК [579+577.27](076.5)

ББК 28.4я73+28.074я73

© Маннапова Р. Т., 2023

© ООО «Проспект», 2023

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ	—	антиген
АМФ	—	альвеолярные макрофаги
АПК	—	антигенпрезентирующая клетка
АТ	—	антитело
БГКП	—	бактерии группы кишечной палочки
БЦЖ	—	вакцина Кальметта–Герена
ВГНКИ	—	Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов
ГАС	—	генерализованный адаптационный синдром
ГЗТ	—	гиперчувствительность замедленного типа
Г-КСФ	—	гранулоцитарный колониестимулирующий фактор
ГМ-КСФ	—	гранулоцитарно-­макрофагальный колониестимулирующий фактор
ДПН	—	дифосфопиридиннуклеотид
Е-РОК	—	метод «спонтанных розеток»
ЕАС-РОК	—	метод розеткообразования
ЖСА	—	желточно-­солевой агар
ИД	—	инфекционная доза
ИФА	—	иммуноферментный анализ
ИЛ	—	интерлейкин
ИЭФ	—	иммуноэлектрофорез
КАМ	—	комплементный антиген из атипичных микобактерий
ККРНГА	—	кровекапельная реакция непрямой гемагглютинации
КСФ	—	колониестимулирующий фактор
КР	—	кольцевая реакция агглютинации с молоком
КУА	—	казеиново-­угольный агар
ЛД	—	летальная доза
ЛТФ-130	—	лиофилизированная вакцина против трихофитии крупного рогатого скота
МАФАМ	—	мезофильные аэробные и факультативно-­анаэробные микробы
МАС	—	местный адаптационный синдром
МБцК	—	минимальная бактерицидная концентрация
МПА	—	мясо-пептонный агар
МПБ	—	мясо-пептонный бульон
МПЖ	—	мясо-пептонный желатин
МПК	—	минимальная подавляющая концентрация
мРНК	—	матричная рибонуклеиновая кислота
МФА	—	метод флюоресцирующих антител
2-МЭ	—	2 мер-каптоэтаиолом (для обработки сывороток)
НСТ-тест	—	тест с нитросиним титразолием
ОМЧ	—	общее микробное число
ПЖА	—	полужидкий мясо-пептонный агар
ПМФ	—	перитониальные макрофаги
ПЦР	—	полимеразная цепная реакция
РА	—	реакция агглютинации
РБП	—	проба с бенгальским розовым
РБТЛ	—	реакция бласттрансформации лимфоцитов
РДП	—	реакция диффузной преципитации
РИФ	—	реакция иммунной флюоресценции
РК	—	реакция Кумбса
РКП	—	реакция кольцепреципитации
РМА	—	реакция микроагглютинации
РН	—	реакция нейтрализации
РНГА	—	реакция непрямой гемагглютинации
РНК	—	рибонуклеиновая кислота
РП	—	реакция преципитации
рРНК	—	рибосомальная рибонуклеиновая кислота
РСК	—	реакция связывания комплемента
РТГА	—	реакция торможения гемагглютинации
РТПХ	—	реакция «трансплантат против хозяина»
СЖН	—	сафранино-­железоновобиоцеоновая среда
СПМ	—	санитарно-­показательные микроорганизмы
тРНК	—	транспортная рибонуклеиновая кислота
ФНО	—	фактор некроза опухоли
ФСБР	—	фосфатно-­солевой буферный раствор
ФЭВ	—	ферментативное экстрагенное вещество
ЦИК	—	циркулирующий иммунный комплекс
ЧБК	—	чистая бактериальная культура
BCR	—	рецептор В-лимфоцита
Ig	—	иммуноглобулин
MHC	—	(Major Histocompatibility Complex, произносится «эм эйч си») — главный комплекс гистосовместимости
NK	—	(от англ. natural killer) — естественный киллер
pH	—	концентрация водородных ионов
TCR	—	рецептор Т-лимфоцитов
АМФ	—	альвеолярные макрофаги
АПК	—	антигенпрезентирующая клетка
БГКП	—	бактерии группы кишечной палочки

Посвящается светлой памяти
моих родителей — Тимергалея
Фахразетдиновича и Нурзиды
Динисламовны Рафиковых

ПРЕДИСЛОВИЕ

Учебник «Микробиология, микология и основы иммунологии» подготовлен для обучения специалистов с учетом требований программы ФГОС ВО по направлениям 36.05.01 «Ветеринария» и 36.04.01/36.03.01 «Ветеринарно-­санитарная экспертиза». Он может быть использован при чтении лекций, проведении лабораторно-­практических, факультативных занятий и выполнении научных исследований. В нем значительное внимание отводится самостоятельной подготовке студентов по курсам «Ветеринарная микробиология и микология», «Микробиология и основы иммунологии». С этой целью к учебнику подготовлено и выпущено учебное пособие «Микробиология, микология и основы иммунологии. Самоконтроль знаний, тестирование студентов», что дает возможность студенту самостоятельно пройти тренажер по теоретическому курсу и тестированный контроль по лабораторно-­практическому занятию к каждой пройденной теме при подготовке к очередному занятию, коллоквиуму, зачету, итоговому контролю знаний и при подготовке к интернет-­экзамену.

Учебник подготовлен в удобной форме как для студентов, так и для преподавателей дисциплин. Составлен с учетом региональных особенностей, современного состояния животноводства в целом по Российской Федерации, а также современных международных требований для подготовки востребованных конкурентоспособных специалистов для сельского хозяйства — ветеринарных врачей и ветеринарно-­санитарных экспертов, в условиях рыночной экономики.

Учебник состоит из семи разделов. Первый раздел посвящен общей микробиологии и последовательно отражает все основные вопросы морфологии и физиологии микроорганизмов. Раздел представлен в виде девяти тем ЛПЗ.

Во втором разделе учебника представлены основные вопросы иммунологии, серологические реакции, методы выделения и исследования иммунокомпетентных клеток, их фракционирования и идентификации. Особое внимание уделяется изучению неспецифических клеточных и гуморальных факторов естественной резистентности организма, с количественным определением иммуноглобулинов различных классов, оценки функциональной активности лейкоцитов и медиаторов межклеточного взаимодействия — цитокинов. В доступной форме в учебнике представлены молекулярные методы диагностики — полимеразной цепной реакции (ПЦР — анализа материала) и метод иммуноферментного анализа (ИФА). Параллельно с лекционным материалом информация второго раздела учебника позволит студентам хорошо освоить иммунологию и современные вопросы иммунодиагностики, иммунотерапии и иммунопрофилактики особо опасных зооантропонозных инфекционных болезней, микозов и микотоксикозов.

Самым важным и главным разделом учебника является третий, в котором представлены в восьми главах различные группы всех возбудителей особо опасных инфекционных болезней. Четвертый раздел посвящен микозам и микотоксикозам. Они по общим признакам объединены в четыре главы. Оба раздела написаны по единой общей схеме: определение болезни, возбудитель в латинской транскрипции, его морфология, культуральные, биохимические, токсигенные и антигенные свой­ства, патогенность и патогенез, устойчивость, диагностика, дифференциальная диагностика, патологическая анатомия, лечение, иммунитет, специфическая профилактика. По всем инфекциям, микозам и микотоксикозам в восьмом разделе учебника представлены схемы лабораторной диагностики и специфической профилактики.

Учебник поможет студентам в облегчении восприятия возбудителей особо опасных инфекционных болезней, микозов и микотоксикозов, лучшего освоения материалов, выносимых на лекции, лабораторно-­практические занятия и на самостоятельное изучение.

В пятом разделе учебника представлены возможности контаминации бактериями и методы микробиологического исследования продуктов животного происхождения: молока, масла, сыров, мяса, яиц, а также кормов.

Шестой раздел учебника посвящен изучению объектов внешней среды — санитарной микробиологии воды, почвы и воздуха, их обсеменения микробами и методы бактериологического анализа с определением их общей бактериальной загрязненности, coli-титра, сoli-индекса.

В седьмом разделе учебника описаны вопросы превращения микроорганизмами соединений углерода (молочнокислое, спиртовое и маслянокислое брожение) и азота (азотфиксация, аммонификация, нитрификация, денитрификация).

Учебник составлен в классическом стиле, для наглядности снабжен иллюстрациями (в виде цветных и черно-­белых фотографий, электроннограмм) и таблицами, отражающими краткие сводки по ключевым аспектам. Надеемся, что он удовлетворит запросы студентов, аспирантов, преподавателей, научных сотрудников, всех, кому он адресован.

Автор выражает искреннюю благодарность рецензентам за ценные замечания и пожелания по улучшению учебника и всем, кто оказал содействие в его подготовке. Замечания и пожелания присылайте на кафедру микробиологии и иммунологии РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева Маннаповой Р. Т.

Раздел 1. ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ: МОРФОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Глава 1.1. Знакомство с микробиологической лабораторией и техникой безопасности при работе с микробиологическими объектами. Оптическая и иммерсионная системы микроскопа. Морфология микроорганизмов

1.1.1. Цель занятия

Усвоить правила работы в бактериологической лаборатории. Ознакомиться с техникой безопасности и личной профилактикой. Освоить работу с микроскопом и особенностями иммерсионной системы. Изучить основные формы бактерий.

1.1.2. Материалы и оборудование

Микроскопы, окрашенные микроскопические препараты с различными формами микроорганизмов, штативы, пробирки, микробиологические петли, пастеровские пипетки, красители, капельницы с растворами красителей, вставленные в гнезда штативов-­колодок, песочные часы, чашки сливные, мостики, микроскопы, вода дистиллированная в колбах для смыва красителей с мазков, банки с дезинфицирующими растворами для отработанных предметных и покровных стекол, салфетки для снятия масла с иммерсионного (× 90) объектива, иммерсионное масло (кедровое или его заменители). Таблицы: схемы устройства биологических микроскопов в разрезе и прохождения лучей в них, схемы устройства и принципы действия электронных микроскопов (просвечивающих, растровых). Формы микроорганизмов.

1.1.3. Теоретический материал

Основная задача бактериологических лабораторий — диагностика болезней сельскохозяйственных животных (включая птиц), пушных зверей, рыб, пчел, а также проведение экспертизы молока, мяса и других пищевых продуктов и кормов.

Лабораторию размещают в отдельном здании, вдали от проезжих дорог. В ней предусматривают приемное отделение, бактериологический, вирусологический, биохимический, серологический и патологоанатомический отделы; выделяют специальные помещения для термостатов, стерилизации посуды и питательных сред, для мытья посуды. Для выполнения работы в асептических условиях оборудуют специальные изолированные помещения — боксы. Лабораторных животных размещают в виварии. Кроме того, имеются комнаты для специалистов, обслуживающего персонала, кабинет заведующего, помещения для библиотеки, склада, весовой, раздевалки и др.

В моечной должны быть столы, раковины, электрические или газовые плиты, сушильный, вытяжной и другие шкафы. Вытяжной шкаф необходим для удаления паров воды и некоторых реактивов, используемых при мойке стекол и посуды. Пол и стены желательно облицевать плиткой.

В стерилизационной комнате могут быть 1 или 2 паровых стерилизатора и стол. При наличии 2 паровых стерилизаторов занятия в нескольких подгруппах можно проводить без длительного перерыва.

Стерилизационная комната должна хорошо вентилироваться. Пар из стерилизатора до подъема давления выводят через резиновую трубку во внешнюю среду или направляют в ведро с водой. Дверь (без стекла) и окна должны открываться наружу.

Средоварочная комната служит для приготовления питательных сред. Стены ее должны быть облицованы плиткой, или покрашены масляной краской, пол выстлан плиткой или покрыт линолеумом. В средоварочной необходимы газовая или электрическая плита, электроплитки, ящики с отсеками для сред в пробирках, столы, шкафы для хранения компонентов сред, мясной воды и некоторых сред в колбах, холодильник.

В термостатной могут находиться термостаты разных форм и размеров. Для выращивания плесневых грибов температура в термостате обычно составляет 20–35 °C, для большинства сапрофитов — 25–30 °C, для возбудителей инфекционных болезней — 35–37 °C, термофилов — 40–45 °C и т. д.

Препараторская — место работы обслуживающего персонала и подготовки оснащения к лабораторно-­практическим занятиям.

Бокс-комната используется для посевов и пересевов культур микроорганизмов и проведения научно-­исследовательской работы в стерильных условиях. Бокс должен быть застеклен, и иметь предбоксник (тамбур) с раздвижной дверью. Стекла нужно хорошо промазать, чтобы не проникал воздух, а вместе с ним и микроорганизмы, стены облицевать плиткой, или окрасить белой масляной краской, пол покрыть линолеумом. Уборку в боксе производят влажным способом с применением дезинфицирующих средств (2–3% раствором натрия гидрокарбоната — питьевой соды, 3–5% раствором фенола и т. д.). Воздух стерилизуют бактерицидными лампами (БУВ-15, БУВ-30 и др.), которые излучают ультрафиолетовые лучи длиной 254 нм.

В зависимости от степени загрязненности воздуха стерилизацию осуществляют от 30 мин до нескольких часов. Находиться в комнате с включенной бактерицидной лампой нежелательно, так как ультрафиолетовые лучи вызывают острое воспаление роговицы глаз. Для предупреждения поражения необходимо пользоваться защитными очками.

В виварии содержат белых мышей, белых крыс, морских свинок, кроликов и других лабораторных животных. Их чаще используют в научно-­исследовательской работе, реже на занятиях, поэтому при отсутствии определенных условий виварий не создают.

Реактивы и некоторые биологические препараты хранят в подвальном помещении или темном сухом стенном шкафу с невысокой температурой в течение года.

Правила работы, техника безопасности и личная профилактика в ветеринарно-­бактериологических лабораториях

1. В помещение входить только в халате и белой шапочке (косынке).

2. В лабораторию нельзя вносить посторонние вещи, продукты.

3. В помещении лаборатории категорически запрещается есть.

4. Перед началом работы обязательно проверяют наличие и исправность приборов, посуды, горелок и др. О замеченных недостатках, неисправностях сообщают преподавателю или лаборанту.

5. Нельзя зажигать одну горелку от другой.

6. Не касаться металлическими и другими предметами проводов и контактных частей электросети. Не включать без ведома преподавателя или лаборанта любую электроаппаратуру.

7. Материал, используемый для учебных занятий, должен рассматриваться как особо опасный.

8. При распаковке материала, присланного для исследования, необходимо соблюдать осторожность — банки с материалом снаружи обтирают ватой, смоченной дезинфицирующим раствором и ставят только на подносы.

9. При исследовании поступившего материала и работе с бактериологическими культурами придерживаются общепринятых в микробиологической практике правил исключающих возможность инфицирования работника.

10. Вскрытие трупов лабораторных животных производят в специальной одежде, на соответственно оборудованном столе с помощью необходимых инструментов, используя для этих целей кювету, залитую воском (или парафином). Инструменты после вскрытия помещают в стакан с дезраствором или обжигают на пламени горелки, на стол класть запрещается.

11. При работе с жидким инфицированным материалом используют резиновые баллоны, соединенные с пипеткой..Жидкости, содержащие микробов, переливают над сосудом с дезраствором.

12. Если патологический материал попал случайно на стол, его немедленно удаляют тампоном, смоченным дезинфицирующим раствором. При попадании зараженного материала на кожу, конъюнктиву, слизистую ротовой полости принимают экстренные меры к обеззараживанию.

13. По окончании работы патологический материал, использованные культуры микроорганизмов, инструменты и поверхность стола обеззараживают. В конце занятия бактериальные культуры и другой материал студенты сдают преподавателю, а рабочее место приводят в порядок.

14. Перед уходом из лаборатории необходимо снять халат, вымыть руки и обработать их спиртом.

Устройство светового микроскопа и работа с ним

Микроскоп — это оптический прибор для получения увеличенных изображений объектов, невидимых невооруженным глазом. Студенческие лаборатории обычно оснащены биологическими микроскопами «Биолам Р-1», МБР-1 (Рис. 1.1.3.1), МБР-3 и др. В микроскопе различают механическую и оптическую части.

Механическая часть включает штатив, предметный столик, тубус и систему винтов для передвижения. Штатив обычно цельнометаллический или пластмассовый с подковообразной или прямоугольной ножкой (микроскопы серии «Биолам»), что обеспечивает устойчивость микроскопа. С его основанием соединена коробка с размещенным в ней механизмом микрометрической фокусировки. К верхней ее части прикреплен предметный столик; по форме он может быть круглый (в старых системах прямоугольный). На его поверхности для фиксации предметных стекол имеются клеммы-­зажимы, вставленные в специальные отверстия. По сторонам предметного столика расположены центровочные винты, при помощи которых он перемещается в разных направлениях. К другой стороне коробки при помощи зубчатки (кремальеры) прикреплен дугообразный или прямоугольный тубусодержатель. В верхней его части расположено револьверное устройство, состоящее из двух пластин и соединенное с тубусом. Нижняя пластина вращается и имеет гнезда для ввинчивания объективов, верхняя закреплена неподвижно.

Тубус (труба) может быть наклонным и прямым. В его верхнюю часть вставляется окуляр. Передвижение тубусодержателя и смонтированных на нем систем осуществляется при помощи винтов. Для грубой наводки служит макрометрический винт, для более точной — микрометрический, полный оборот которого поднимает или отпускает тубусодержатель на 0,1 мм.

На барабане микрометрического винта нанесено 50 делений, каждое из которых соответствует перемещению системы на 2 мкм. Механизм макрометрической фокусировки состоит из системы зубчатых колес и рычага. Во избежание поломок обращаться с ним нужно осторожно. Не рекомендуется вращать его до упора. При вращении рукояток макро- и микрометрического винтов по часовой стрелке тубус микроскопа опускается, против часовой стрелки — поднимается. Вращением рукояток грубой наводки навстречу друг другу находим изображаемый объект.

Оптическая часть включает объективы, окуляры и осветительный аппарат. Объективы — самая важная и наиболее ценная часть микроскопа. Они представляют систему линз, закрепленных в металлической оправе, число которых доходит до 10. Передняя (фронтальная) линза — самая малая, она производит основное увеличение, остальные (коррекционные) исправляют недостатки оптического изображения. Объективы делят на ахроматы и апохроматы. Первые имеют дефект — хроматическую аберрацию (происходит разложение света на составные части спектра). Они просты по устройству и дешевы, поэтому нашли наибольшее распространение. Апохроматы лишены такого недостатка. Они состоят из большого количества линз, изготовленных из стекла разного химического состава.

Все объективы делят на сухие и иммерсионные (погруженные в масло или воду). У сухих между фронтальной линзой и рассматриваемым препаратом находится воздух, у иммерсионных пространство между линзой и препаратом заполнено маслом (кедровым, касторовым, гвоздичным и др.) или водой. Стекло, на котором изготовлен препарат, стекло объективов и масло (кедровое) имеют почти одинаковый показатель преломления света (1,25 и 1,515). Лучи, проходя из одной среды в другую, почти не преломляются, свет не рассеивается, изучаемые объекты хорошо видны и не искажаются. Показатель преломления света, близкий к стеклу, имеет и другие вещества: касторовое масло (1,48–1,49), гвоздичное масло (1,53), смесь касторового и гвоздичного масел (1,515). Воздух и стекло имеют различные данные преломления света (1,0 и 1,52), в результате чего, лучи света при переходе из одной среды в другую преломляются, рассеиваются, происходит частичное искажение объектов. Однако поскольку сухие системы дают сравнительно небольшое увеличение, сильных искажений не наблюдается.

Рис. 1.1.3.1. Микроскоп МБР-1: 1 — подошва или башмак; 2 — предметный столик; 3 — винты для перемещения предметного столика; 4 — клеммы; 5 — конденсор; 6 — кронштейн конденсора; 7 — винт, укрепляющий конденсор; 8 — винт конденсора; 9 — рукоятка ирисовой диафрагмы конденсора; 10 — зеркало; 11 — тубусодержатель; 12 — макрометрический винт; 13 — микрометрический винт; 14 — револьвер; 15 — объектив; 16 — тубус; 17 — винт для крепления тубуса; 18 — окуляр

Для иммерсионных объективов характерно короткое фокусное расстояние и большое увеличение. Расстояние между фронтальной линзой и препаратом невелико, поэтому пользоваться этой системой во избежание повреждения линзы и препарата нужно осторожно. Иммерсионные объективы (х 90) рабочих (студенческих) микроскопов имеют пружинную оправу, что исключает повреждение фронтальной линзы и препарата при их соприкосновении. Сухие системы имеют следующие обозначения: ×8, ×20, ×40.

Окуляры вставлены в верхнюю часть тубуса. Они состоят из двух плосковыпуклых линз, обращенных выпуклыми сторонами к объективу и заключены в металлическую оправу. Между линзами имеется постоянная металлическая диафрагма. Линза, обращенная к глазу, называется глазной, к объективу — собирательной. Короткие окуляры дают более сильное увеличение, длинные — слабое. Окуляры в зависимости от этого обозначаются: ×7, ×10, ×15, ×20. Цифры на объективах и окулярах показывают увеличение этих систем. Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. Так, при увеличении объектива ×8 и окуляра ×7 увеличение микроскопа равно 56, объектива ×90 и окуляра ×20–1800.

Разрешающая способность микроскопа — это величина, обратная тому наименьшему расстоянию, на котором могут быть видны раздельно два соседних элемента структуры. Это одна из важных характеристик микроскопов, в том числе электронных. Самая высокая разрешающая способность у просвечивающих микроскопов. Они превосходят по этому параметру световые микроскопы в несколько тысяч раз. Высокое разрешение у электронных микроскопов достигается очень малой длиной волны электронов. Чем короче длина волны источника излучения, тем выше разрешающая способность микроскопа. Она составляет 1350 (90×15).

Осветительный аппарат находится под предметным столиком и представлен конденсором Аббе, диафрагмой и зеркалом. Конденсор Аббе состоит из двух линз, заключенных в металлическую оправу и предназначенных для собирания лучей света, идущих от зеркала. Ирисовая диафрагма находится под конденсором и служит для регулирования освещения препарата путем сужения или расширения ее при помощи рычага. Окрашенные препараты, частично задерживающие свет, рассматривают при открытой диафрагме. Неокрашенные препараты (висячую или придавленную капли) рассматривают с полуоткрытой диафрагмой в слабом пучке света. В таком поле зрения увеличивается контрастность неокрашенных форм микробов, что облегчает их нахождение. Микроскопы серии «Биолам» имеют дополнительную откидную линзу в оправе, которая используется при работе с объективами малого увеличения, зеркало — плоскую и вогнутую поверхности и служит для отражения лучей света. Плоским зеркалом пользуются при хорошем естественном освещении и при микрофотосъемках, вогнутым — при искусственном и слабом естественном.

Микроскоп МБИ-1 имеет два тубуса: наклонный и вертикальный. Первый позволяет рассматривать объекты на горизонтальной поверхности предметного столика. Макро- и микрометрический винты расположены в нижней части штатива. При их вращении руки лежат на столе и длительная работа не вызывает усталости. Бинокулярные микроскопы МБР-3, «Биолам» и другие имеют два наклонных тубуса, что позволяет рассматривать препарат обоими глазами.

Микроскопы, используемые при работе студентов, дают плоское увеличение. В настоящее время применяются объемные микроскопы, которые позволяют рассматривать исследуемый объект в трех измерениях. Такой эффект достигается путем смены фокусного расстояния 50 раз в минуту, создавая оптическое впечатление объемности.

В проекционных микроскопах большое значение имеет освещенность препаратов. Чем она выше, тем лучше видимость. К ним относится лазерный микроскоп с мощным усилителем света, который в отличие от других подобных источников не разрушает биологические объекты и позволяет проецировать изображение на экран.

Работа с иммерсионной системой

Объективы малого увеличения (×3,5, ×8, ×9) применяют главным образом для предварительного осмотра препарата, объективы среднего увеличения (×20, ×40) — для изучения крупных клеток микроорганизмов (например, грибов); эти объективы называются сухими, поскольку при микроскопии между фронтальной линзой и препаратом находиться воздух. При этом благодаря различию показателей преломления воздуха (n = 1) и стекла (n = 1,52) часть лучей, освещающих препарат, рассеивается и не попадает в объектив.

Объективы больших увеличений (×85, ×90) носят название иммерсионных. При работе с ними необходима максимальная освещенность препарата; устранение рассеивания, неизбежного при работе с сухими объективами, в данном случае достигается путем использования иммерсионных жидкостей, у которых показатель преломления близок к показателю преломления стекла (рис. 1.1.3.2).

Рис. 1.1.3.2. Схема лучей в иммерсионной системе: 1 — объектив микроскопа; 2 — предметное стекло; 3 — объект исследования; 4 — иммерсионное масло; 5 — лучи света; 6 — фронтальная линза объектива

Вначале под малым увеличением микроскопа наводят свет и определяют на препарате участок микроскопирования. Затем на выбранное место наносят каплю кедрового масла и осторожно (под контролем глаз с боку) погружают в нее фронтальную линзу иммерсионного объектива (×90).

По окончании работы объектив поднимают, убирают препарат, а с фронтальной линзы кусочком фильтровальной бумаги убирают остатки масла. Иммерсионные объективы имеют короткое фокусное расстояние (до 2,3 мм) поэтому наводить на резкость следует путем поднимания объектива, а не опускания его, так как при небольшом рабочем расстоянии можно раздавить препарат и повредить фронтальную линзу. После грубой наводки, которую проводят с помощью макрометрического винта, руки переводят на микрометрический винт и осуществляют более точную фокусировку

Морфология микроорганизмов

По форме бактерий подразделяют на три основные группы: шаровидные (кокки), цилиндрические (палочки) и извитые (рис. 1.1.3.3.).

Рис. 1.1.3.3. Основные формы бактерий: а — микрококки; б, в — диплококки; г — стрептококки; д — стафилококки; е — тетракокки; ж — сарцины; з, и, к — палочки; л — вибрионы; м — спириллы

Кокки. Шарообразные факультативно-­анаэробные, редко подвижные, не образующие спор микробы. Кокки относятся к грамположительным микроорганизмам. В зависимости от расположения клеток после деления подразделяются на: Микрококки — единично или беспорядочно расположенные кокки, в диаметре не превышают 0,5 мкм. Они являются сапрофитами, обитателями воды, воздуха.

Диплококки — кокки, располагающиеся попарно, делятся в одной плоскости, как результат деления одной особи. Они неподвижны, не образуют спор.

Имеются сапрофитные формы (в почве, водоемах), а также патогенные — пневмококки, менингококки и др.

Стрептококки — (гр. streptos — плетенный, цепь) деление их происходит в одной плоскости и образующиеся клетки не разъединяются, располагаясь цепочками различной длины. Грамположительные кокки, не образующие спор. Подразделяются на патогенные — возбудители многих инфекционных болезней; фекальные (энтерококки) — обитатели кишечника; молочнокислые — встречаются на различных растениях, в молоке, используются для получения молочнокислых продуктов.

Стафилококки — (гр. staphile — виноградная гроздь) делятся в различных плоскостях без особой закономерности, образуя беспорядочное скопление клеток, иногда напоминающее грозди винограда. Грамположительные факультативные анаэробы не образующие спор являются возбудителями (чаще всего St. aureus) различных гнойно-­воспалительных процессов (абсцессов,

флегмон, фурункулов, карбункулов, остеомиелитов, гнойных плевритов, ангин, сепсиса, маститов и др.), пищевых токсикоинфекций и т. д.

Тетракокки — сочетание шаровидных микробов по четыре, деление у которых происходит в двух взаимно перпендикулярных плоскостях.

Сарцины (гр. sarcio — соединяю) — кокки, соединенные в виде пакетов в результате деления клеток в трех взаимно перпендикулярных плоскостях. Среди них болезнетворных видов не обнаружено.

Палочковидные бактерии. Самая многочисленная и разнообразная группа. Палочковидные микроорганизмы подразделяются на бактерии, бациллы и клостридии. Величина палочковидных форм колеблется от нескольких долей микрометра до 10–15 мкм и более. Различают короткие, длинные, тонкие и толстые палочки. Концы у них иногда закруглены, резко обруб­лены. Некоторые палочковидные бактерии имеют разветвленную (микобактерии) или овоидную форму, характерную для пастерелл. Они могут располагаться одиночно или беспорядочно, группироваться попарно (диплобактерии, стрептобациллы). Встречаются как сапрофитные, так и патогенные виды.

Бактерии — имеют цилиндрическую форму и не образуют спор. Различают палочки, образующие споры. Среди спорообразующих существуют собственно бациллы и клостридии.

Бациллы — спорообразующие палочки, по типу дыхания аэробы, т. е. для своего развития нуждаются в свободном молекулярном кислороде. Грамположительные, образующие при неблагоприятных условиях (вне организма) споры. Диаметр споры меньше ширины клетки. Большинство из них сапрофиты, некоторые служат возбудителями болезней, напр. Bac. antracis.

Клостридии — спорообразующие палочки, по типу дыхания анаэробы, диаметр споры превышает ширину микробной клетки. Поэтому в процессе спорообразования клостридии изменяют свою конфигурацию.

Термин «клостридии» происходит от греческого слова closter — «веретено». Они являются возбудителями клостридиозов: эмфизематозного карбункула, злокачественного отека, брадзота, столбняка, ботулизма и др.

Извитые формы. Это тонкие бактерии, тело которых спиралевидно изогнуто. Извитые бактерии разделяются на вибрионы, спириллы и спирохеты. По величине бактерии бывают крупные (более 4 мкм), средние (1–4 мкм) и мелкие (0,5 мкм).

Вибрионы — имеют форму запятой или летящей чайки, поворот тела вокруг оси не превышает четверти оборота. Они могут встречаться в различных таксономических группах (возбудители кампилобактериоза сельскохозяйственных животных и холеры человека).

Спириллы — характеризуются небольшим числом крупных завитков (не более пяти). Передвигаются с помощью жгутиков. Грамотрицательные, подвижные, факультативные — аэробы.

Спирохеты — имеют штопорообразную форму с большим количеством завитков. Грамотрицательные активно подвижные микроорганизмы. На конце тела пучком расположены жгутики.

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Ознакомиться с бактериологической лабораторией, ее основным оборудованием, правилами техники безопасности.

Задание 2. Изучить устройство светового микроскопа, принципы иммерсионной и темнопольной микроскопии.

Задание 3. Провести микроскопию готовых окрашенных препаратов, определить и зарисовать формы микроорганизмов.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Принцип работы с иммерсионной системой.

2. Основные морфологические признаки бактерий.

3. Каковы основные правила работы в микробиологической лаборатории.

4. Окуляр и другие оптические части микроскопа, определение степени увеличения микроскопа.

5. Какими составными частями представлен осветительный аппарат и их назначения.

6. Назначение и правила работы с макро- и микрометрическими винтами.

7. Назначение микроскопа при люминесцентной микроскопии.

8. Какие группы шаровидных бактерий различают по их расположению?

9. На чем основано деление бактерий на собственно бактерии, бациллы и клостридии?

10. Какие морфологические группы имеются среди извитых форм?

Глава 1.2. Приготовление, фиксация и окраска препаратов. Микробиологические краски. Простые и сложные методы окрашивания микроорганизмов (по Граму, по Цилю–Нильсену)

1.2.1. Цель занятия

Овладеть методикой приготовления мазка-­препарата для микроскопии из микробной взвеси. Приготовить, окрасить (фуксином или метиленовой синькой) и зарисовать препараты из микробных культур. Отработать методику простого и сложных методов окраски приготовленных препаратов.

1.2.2. Материалы и оборудование

Рабочие растворы красок, спирт ректификат 96%, дистиллированная вода, фильтровальная бумага, предметные стекла, бактериологические петли, пинцеты, пробирки с микробными взвесями, микроскопы, сливные чашки, мостики, карандаши или чернила по стеклу, песочные или другие часы, горелки (спиртовки), спички, кедровое масло, окрашенные препараты стрептококка и диплококка, таблица — морфология микробов.

1.2.3. Теоретический материал

Приготовление бактерийных препаратов для микроскопирования

Для обнаружения микроорганизмов в исследуемом материале и изучения их тинкториально-­морфологических свой­ств, необходимо приготовить препараты, окрасить их и изучить под микроскопом.

Препараты для микроскопирования готовят на предметных стеклах. Материалом служат взвеси бактериальных культур, выросших на питательных средах, молоко, мясо. Из таких материалов готовят препараты-­мазки. Из тканей различных органов — препараты-­отпечатки.

Предметные стекла, используемые при этом, должны быть чистыми и хорошо обезжиренными. Стекла хранят в банках с притертыми пробками в смеси из равных частей этилового спирта и эфира или в 96,6% спирте ректификате. Возможно, обезжиривание предметных стекол кусочком мыла.

Нанесение микробной взвеси на стекло производят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой. Бактериологические петли готовят из платиновых или нихромовых нитей в виде замкнутой петли, диаметром 2–3 мм.

Приготовление препарата для микроскопии складывается из следующих этапов:

1. Обезжиривание предметного стекла.

2. Приготовление мазка.

3. Высушивание препарата.

4. Фиксация мазка.

5. Окраска мазка.

В правильно приготовленном препарате микробные клетки должны быть расположены в один слой.

Обезжиривание предметного стекла. Стекла, не бывшие в употреблении, сначала моют в воде, затем выдерживают в смеси спирта-­эфира, фламбируют над пламенем горелки — это и есть обезжиривание. Новые стекла можно готовить путем кипячения 10 мин в 1% растворе натрия гидрокарбоната (соды), промывания в дистиллированной воде с добавлением 0,5% соляной кислоты с целью нейтрализации и окончательного споласкивания в дистиллированной воде.

Приготовление мазка. Для приготовления мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде, на обезжиренное предметное стекло наносят бактериологической петлей небольшую каплю стерильного физиологического раствора. Затем петлю прокаливают до красна (стерилизуют фламбированием), внося ее в пламя горелки в вертикальном положении, после чего из пробирки с культурой вынимают пробку захватывая ее мизинцем и ладонью правой руки (рис. 1.2.3.1.).

Пробирку с культурой следует держать левой рукой, пробкой к себе. Вынув пробку, края пробирки обжигают и вносят в нее бактериологическую петлю. Прежде чем захватить небольшое количество культуры, петлю охлаждают, касаясь стенок пробирки. Петлю с культурой осторожно вынимают, еще раз обжигают края пробирки, а культуру вносят в приготовленную ранее каплю физраствора, тщательно размешивают и равномерно распределяют по стеклу в виде небольшого овала или круга (1,5–2 см в диаметре). По окончании приготовления мазка петлю вновь прокаливают.

Рис. 1.2.3.1. Схема приготовления препарата-­мазка

Для приготовления мазка из бульонной культуры на предметное стекло петлей 1–2 раза наносят исследуемый материал и равномерно распределяют.

Приготовленный препарат высушивают на воздухе, просохший мазок фиксируют.

Пастеровскими пипетками делают мазки из жидкостей и бульонных культур. Пипетка должна быть стерильной. Над пламенем горелки отламывают запаянный конец и набирают материал. После нанесения капли культуры на предметное стекло и ее распределения пипетку отпускают в сосуд с дезинфицирующим раствором. Мазок высушивают при комнатной температуре.

Фиксация мазка. Фиксацию мазка проводят физическим и химическим способами.

Физический способ фиксации — над пламенем горелки. Для этого предметное стекло с мазком берут большим и указательным пальцами или пинцетом и проводят 3–4 раза над пламенем горелки, каждый раз, прикладывая стекло к коже руки. Ощущение жжения свидетельствует о том, что мазок фиксирован. При этом бактерии погибают, плотно прикрепляясь к стеклу. Этот способ нельзя применять при исследовании клетки.

Химический способ используют для фиксации мазков из крови и мазков-­отпечатков, так как при действии высоких температур разрушаются клеточные элементы. При этом препараты погружают в фиксирующую жидкость: в метиловый спирт — на 5 минут, в этиловый спирт — на 10 минут, ацетон — 5 минут, смесь Никифорова (равный объем спирта и эфира) — на 15 минут.

Цель фиксации:

1) Закрепить бактерий на стекле.

2) Умертвить микробные клетки, обезопасив себе работу.

3) Коагулировать белок клетки, после чего она лучше воспринимает краситель.

Окраска мазка

В микробиологической практике для окрашивания микробов используют анилиновые красители (основные, кислые и нейтральные). Наиболее часто употребляемыми красителями являются следующие:

— синие — метиловый синий, водный синий, опаловый синий;

— красные — фуксин основной, конго красный, сафранин, нейтральный красный, фуксин кислый;

— фиолетовые — метиловый фиолетовый, кристаллический фио­летовый, генцианвиолет;

— зеленые — малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый, светло-­зеленый;

— желто-­коричневые — хризоилин, везувин.

При простом методе окраски применяют только один краситель. Раствором краски покрывают охлажденный фиксированный мазок, выдерживают 2–5 минут, краску сливают, мазок промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсией. Этот способ окраски позволяет обнаружить в материале микроорганизмы и дать некоторые представления об их морфологии.

При сложных методах окрашивания применяют несколько растворов красителей и реактивов. Они основаны на физико-­химических различиях состава микробных клеток. Эти методы позволяют помимо морфологии бактерий, определить их тинкториальные особенности (различное окрашивание при использовании специальных методов) и наличие или отсутствие структурных элементов клетки (капсула, спора), что имеет важное дифференциально-­диагностическое значение. Химический состав и строение клеточной стенки микробов различны, поэтому они окрашиваются одними и теми же красителями по-разному и неодинаково отдают их при последующем обесцвечивании этиловым спиртом, кислотами и другими реактивами. Части микробной клетки избирательно реагируют на красящие растворы. На этом свой­стве основаны сложные (дифференциальные) методы окрашивания микробов. Для сложного окрашивания используют несколько красителей. В лабораторной практике применяют методы Грама, Циля–Нильсена, Козловского и др.

Окраска по Граму

Метод Грама (модификация по Синеву). Этот метод позволяет все микроорганизмы разделить на две группы: грамположительные (Гр⁺) и грамотрицательные (Гр^–).

На фиксированный мазок помещают:

1. Кусочек фильтровальной бумаги, пропитанной 1%-ным спиртовым раствором генцианвиолета. Наносят на бумажку 2–3 капли воды и окрашивают 2–3 минуты. Бумагу снимают, мазок не промывают.

2. Наносят раствор Люголя на 2 минуты, смывают водой.

3. Обрабатывают 96%-ным этиловым спиртом в течение 20–30 секунд и тщательно смывают мазок водой.

4. Докрашивают мазок фуксином в течение 2–3 мин и промывают водой.

5. Высушивают на воздухе и микроскопируют.

Микроскопическая картина: грамположительные микроорганизмы окрашиваются в фиолетовый цвет, а грамотрицательные — в розовый.

Окраска микроорганизмов по этому методу зависит от химического состава клеточной стенки (наличие муреина и частично липида), цитоплазмы и pH среды.

Окраска по Цилю–Нильсену

На фиксированный мазок наносят небольшой кусок фильтровальной бумаги, на него наносят раствор карболового фуксина, снизу препарат подогревают над пламенем горелки до появления паров и оставляют на «мостике» 5–7 минут. Затем краску с бумагой убирают (не промывая). Наносят 3–5% раствор серной кислоты, окрашивают 5–7 минут, хорошо промывают водой. Затем добавляют раствор метиленовой сини (по Леффлеру), окрашивают 4–5 минут. Препарат промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: кислото-­спиртоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет (не обесцвечиваются кислотой), некислотоустойчивые — в синий (окрасившись первоначально фуксином в красный цвет, легко обесцвечиваются кислотой и воспринимают дополнительную окраску метиленовой сини).

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Приготовить препараты бактерий из бульонных и агаровых культур.

Задание 2. Окрасить препараты простым методом (фуксином или метиленовой синькой) и по Граму, зарисовать.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Красители, применяемые в микробиологии.

2. Способы и цели фиксации.

3. Порядок приготовления препарата для микроскопии и простой метод окраски.

4. Методика приготовления мазка.

5. Способы обработки предметных и покровных стекол.

6. Какие существуют методы фиксации?

7. Чем обуславливается различное окрашивание бактерий по Граму?

9. Каково действие спирта при окрашивании по Граму?

10. Какова особенность окраски по Цилю-­Нильсену?

Глава 1.3 Методы окрашивания спор и капсул. Исследование бактерий на подвижность

1.3.1. Цель занятия

Овладеть методами окрашивания препаратов на капсулы и споры. Приготовить, окрасить и зарисовать препараты из микробных культур на споры. Освоить методики определения подвижности микроорганизмов

1.3.2. Материалы и оборудование

Рабочие растворы красок, спирт ректификат 96%, дистиллированная вода, фильтровальная бумага, предметные стекла, бактериологические петли, пинцеты, пробирки с микробными взвесями, микроскопы, сливные чашки, мостики, карандаши или чернила по стеклу, песочные или другие часы, горелки (спиртовки), спички, кедровое масло, окрашенные препараты на капсулы, таблицы и рисунки спор и капсул микробов.

1.3.3. Теоретический материал

Окраска спор

Все методы окраски спор основаны на обеспечении проникновения красителя через трудноокрашиваемую оболочку споры. Поэтому применяют протраву.

Окраска спор по Златогорову. На фиксированный мазок наносят:

1. Карболовый фуксин, окрашивают 5–10 мин

2. 2% раствор серной кислоты, выдерживают 2–3 сек.

3. Раствор метиленовой сини, окрашивают 3–5 мин

Микроскопическая картина: споры красного цвета, вегетативные формы — синие.

Окраска капсул

Тело микробной клетки покрыто рыхлым слизистым слоем. У некоторых видов микроорганизмов этот слой развивается очень сильно и тогда он называется капсулой.

Капсула — слизистый слой оболочки, муциноподобное вещество, высокомолекулярный полисахарид, который синтезируется в цитоплазме и секретируется на поверхности клеточной стенки (является производным наружного слоя оболочки).

Наличие капсулы является важным диагностическим признаком при идентификации и дифференциации возбудителей некоторых инфекций (сибирской язвы, пневмококковой пневмонии и др.) Патогенные микроорганизмы образуют капсулу в инфицированном организме. Она является фактором вирулентности и защищает бактериальную клетку от фагоцитоза и бактерицидного действия сыворотки крови. Размеры их чаще превышают тело микробной клетки. Химический состав капсул неоднородный: одни из них состоят из комплекса белков, другие — из полисахаридов. Капсула и остальная часть клетки окрашиваются неодинаково: первая как бы выполняет роль защиты и часто встречается у патогенных микроорганизмов.

Существует несколько методов окрашивания капсул.

Капсульное вещество плохо окрашивается. Поэтому при приготовлении препарата для обнаружения капсулы выполняют следующие правила:

1. Мазок готовят из свежего материала, так как капсула быстро лизируется.

2. Фиксируют мазок химическим способом, для окраски применяют метахромотические краски, при использовании которых цитоплазма окрашивается в один цвет, а капсула — в другой;

3. Промывать мазок водой следует слабо и кратковременно.

Окраска капсул по Михину. На фиксированный мазок наносят:

1. Метиленовый голубой Леффлера (лучше старый раствор), окрашивают 2–3 мин, при подогревании.

2. Смывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина: тела микробных клеток темно-­синего цвета, капсулы — светло-­розового.

Окраска капсул по Ольту. На фиксированный мазок наносят:

1. Свежий горячий 2%-ный раствор сафранина, окрашивают 5–7 минут.

2. Быстро промыть водой и высушивают.

Микроскопическая картина: тело клетки окрашивается в красно-­кирпичный цвет, капсула — в желто-­оранжевый.

Определение подвижности микроорганизмов

У подвижных видов органами передвижения являются жгутики, которые осуществляют вращательные движения. Расположение их на теле микробной клетки различное. Жгутики бывают различной длины. Их диаметр настолько мал, что они невидимы в световом микроскопе (менее 0,2 мкм). У разных групп бактерий количество и расположение жгутиков неодинаково. Жгутики плохо воспринимают красители. Методы сложной окраски искажают подлинный вид жгутиков, поэтому в лабораториях окраску жгутиков не осуществляют, а исследуют бактерии в живом состоянии.

В зависимости от расположения и количества жгутиков микроорганизмы подразделяют на:

а) монотрихи — микроорганизмы, имеющие на одном из полюсов один жгутик. Это самые подвижные бактерии, движения активные, поступательные (псеудомонас);

б) лофотрихи — микроорганизмы, имеющие на одном из полюсов пучок жгутиков, движения активные, поступательные (листерии);

в) амфитрихи — микроорганизмы, имеющие жгутики на обоих полюсах микробной клетки, передвигаются беспорядочно;

г) перитрихи — микроорганизмы, у которых жгутики расположены по всей поверхности клетки, передвигаются беспорядочно (кишечная палочка).

Рис. 1.3.3.1. Типы расположения жгутиков у бактерий

Для определения подвижности у бактерий необходимо использовать культуру не старше суточного возраста, так как старые культуры утрачивают способность передвигаться. Исследование проводят путем приготовления висячей или раздавленной капли.

Метод «висячая капля». Висячую каплю готовят на предметном стекле с углублением (луночкой). Край луночки смазывают тонким слоем вазелина и наносят на покровное стекло микроорганизмы. Если они выращены в жидкой среде, берут каплю такой культуры, если на плотной, то сначала на покровное стекло наносят каплю изотонического раствора натрия хлорида, а затем культуру микробов. Предметное стекло проворачивают на 180° и аккуратно опускают на покровное так, чтобы капля оказалась в центре углубления, после чего его возвращают в прежнее положение. В таком препарате капля подвешена с внутренней поверхности покровного стекла и находится в герметически закрытой влажной камере Это позволяет наблюдать за движением микробов в течение длительного времени. Препарат рассматривают в слегка затемненном поле (диафрагму сужают), что увеличивает контрастность неокрашенных форм.

Метод «раздавленная капля». Каплю бактериальной взвеси наносят на обычное предметное стекло, осторожно накрывают покровным стеклом и слегка придавливают пальцем. Микроскопию проводят, так же как и в методе «висячая капля».

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Приготовить препараты бактерий из бульонных и агаровых культур.

Задание 2. Окрасить препараты на споры по методу Златогорова, зарисовать.

Задание 3. Определить подвижность предложенных культур микроорганизмов методами «висячая» и «раздавленная капля».

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Какова особенность окраски препаратов на споры?

2. Какие применяют методы окрашивания капсул?

3. Как исследуют микроорганизмы на подвижность?

Глава 1.4. Питательные среды для культивирования микроорганизмов. Приготовление основных питательных сред. Техника посева

1.4.1. Цель занятия

Освоить основные методики приготовления искусственных питательных сред, наиболее широко применяемых в лабораториях.

Изучить способы посевов и пересевов микроорганизмов на питательные среды. Произвести посев культур микробов на МПБ и МПА (в пробирки), а также посев смеси микробных культур (для выделения чистых) методом рассева на чашки Петри с МПА. Ознакомиться с аппаратом для культивирования микроорганизмов (термостатом).

1.4.2. Материалы и оборудование

Компоненты для приготовления питательных сред: агар-агар, желатина, пептон, х. ч. NaCl, колбы с мясной водой, раствор 8–10%-ный KOH, воронки, гигроскопическая вата, марля, фильтровальная бумага, градуированные пипетки различной емкости, дистиллированная вода, стерильные пробирки с ватными пробками, компаратор, электроплитки. Готовые сухие среды.

Пробирки с культурами микроорганизмов, смесь микробов в изотоническом растворе хлорида натрия из культур Вас. rasentericis, Bac. mycoidis, Sarcina flawa, Sarratia marcescens, которую готовят перед посевом. Пробирки с МПА и МПБ для каждого студента, стерильные чашки Петри, микробиологические петли, иглы, шпатели, карандаши по стеклу, спиртовки, спички. Таблица: схема посева микроорганизмов на питательные среды.

1.4.3. Теоретический материал

Требования к питательным средам

Основные требования предъявляемые к питательным средам:

1. Стерильность и по возможности прозрачность;

2. Содержание необходимых для жизнедеятельности клеток биохимических факторов — источников энергии, углерода, азота, серы, а также неорганических ионов — обязательно в форме, доступной для усвоения микроорганизмами;

3. Оптимальные значения ряда биофизических показателей: концентрации водородных ионов (рН), окислительно-­восстановительного потенциала (Еh), активности воды (а_w) осмотического давления.

Классификация питательных сред и способы их приготовления

Питательные среды классифицируют в зависимости от исходных компонентов, консистенции, целевого назначения, химического состава. В зависимости от химического состава и исходных компонентов различают следующие типы питательных сред.

Среды неопределенного химического состава. Их подразделяют на:

1. Среды животного происхождения (исходные продукты — мясо, рыба, яйца, молоко и т. д.);

2. Среды растительного происхождения (исходные продукты — соя, горох, картофель, морковь и т. д.).

Некоторые продукты используют в натуральном виде (картофель, морковь, молоко и т. д.), но чаще животные и растительные ткани подвергают различной обработке (экстрагированию, ферментативному или кислотному гидролизу).

Среды известного химического состава (синтетические). В них входят известные химические соединения (соли, углеводы, аминокислоты, витамины и т. д.) в оптимальном количественном соотношении. Питательные синтетические среды используют, когда выращиваемую клеточную массу необходимо максимально освободить от балластных органических соединений, входящих в состав обычных сред, например при получении диагностических аллергенов, или при изучении метаболических потребностей микроорганизма в том или ином конкретном химическом соединении.

По консистенции питательные среды дифференцируют на плотные, полужидкие и жидкие.

Жидкие питательные среды. Готовят, используя экстракты, гидролизаты, растворы из исходных продуктов.

Полужидкие и плотные питательные среды. Необходимую консистенцию среде придают добавлением различных уплотнителей.

Агар-агар (малайское желе) — полисахарид, продукт переработки некоторых морских водорослей. Плавится при 80–86 °C, затвердевает при 40 °C. Для получения плотных сред его добавляют в количестве 1,5–2%, реже 3%; полужидких — 0,3–0,7%.

Желатина — экстракт из тканей, содержащих много коллагена (кости, хрящи, сухожилия и т. д.). Желатиновый гель плавится при 25 °C, что делает его неудобным для выращивания микроорганизмов с температурным оптимумом 37–38 °C. Кроме того, ряд бактерий выделяют протеолитические ферменты, разлагающие желатину. Обычно в питательные среды вносят 10–20% желатины.

По целевому назначению различают общеупотребительные (основные), обогащенные, специальные, элективные (избирательные) и питательные дифференциально-­диагностические среды.

Общеупотребительные (основные) среды. Их применяют для культивирования относительно неприхотливых микроорганизмов.

В качестве исходных компонентов для приготовления основных сред используют наиболее часто мясную воду, перевар Хоттингера, растительные гидролизаты.

Мясная вода: говядину освобождают от костей, жира, сухожилий, пропускают через мясорубку. Мясной фарш заливают водопроводной водой в соотношении 1:2, кипятят 1 ч. После кипячения мясную воду охлаждают, фильтруют через ватно-­марлевый фильтр, затем доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают по емкостям, закрывают ватно-­марлевыми пробками и стерилизуют при 120 °C 20 мин

Перевар Хоттингера готовят из мясных отходов путем их триптического гидролиза. Жир, фасции, сухожилия мелко нарезают, заливают кипящей водой в соотношении 1:2, кипятят, охлаждают до 45 °C и добавляют панкреатин, подщелачивают раствором карбоната натрия до рН 7,8–8,0, встряхивают и добавляют хлороформ (10 мл/л), плотно закрывают, выдерживают в теплом месте 10 дней, получают продукт гидролиза (перевар).

Мясо-пептонный бульон (МПБ). К 1 л мясной воды добавляют 1% пептона и 0,5% хлорида натрия, устанавливают необходимый рН дробным добавлением 10%-го раствора гидроксида натрия или гидроксида калия. Фильтруют через бумажный фильтр, разливают по колбам, пробиркам и стерилизуют при 120 °C 15–20 мин

Мясо-пептонный агар (МПА): к МПБ добавляют 2–3% промытого мелко нарезанного агар-агар, нагревают до расплавления агара, доводят до кипения, в горячем виде проверяют рН, затем, если необходимо, доводят его до нужного значения (7,2–7,6), фильтруют через ватно-­марлевый фильтр. Профильтрованный горячий агар разливают по пробиркам и колбам, стерилизуют автоклавированием при 1 атм. 20–30 мин Чтобы получить скошенную поверхность агара, удобную для посева, после стерилизации пробирки с расплавленным МПА оставляют при комнатной температуре до уплотнения в наклонном положении (конец с пробкой приподнят).

Широко используют культивирование микроорганизмов на плотных питательных средах в чашках Петри. Диаметр стандартной чашки Петри около 10 см, выпускают чашки меньшего и большого диаметров, а также одноразовые пластиковые стандартные стерильные чашки Петри над пламенем горелки наливают около 20 мл расплавленного и охлажденного до 45–50 °C питательного агара, чашки помещают на горизонтальную поверхность до застывания агара.

Полужидкий мясо-пептонный агар (ПЖА) готовят, как МПА, но добавляют 0,25% агара. Кипятят при помешивании до полного расплавления агара, устанавливают рН 7,2–7,6, фильтруют в горячем виде, стерилизуют в автоклаве.

Мясо-пептонная желатина (МПЖ): к МПБ добавляют 10–20% измельченной желатины, нагревают до расплавления уплотнителя, устанавливают рН 7,2–7,4, кипятят, фильтруют через ватно-­марлевый фильтр, разливают по пробиркам и стерилизуют дробно в аппарате Коха три дня по 20 мин или однократно в автоклаве при 112 °C при 15 мин

Бульон Хоттингера: основной перевар Хоттингера разводят водопроводной водой в соотношении 1:5 (1:8) до содержания аминного азота 120 мг%, добавляют 1,5% хлорида натрия, 0,1 г гидрофосфата калия, устанавливают рН 7,4–7,6, кипятят 15–20 мин, фильтруют через ватно-­марлевый или бумажный фильтр, разливают по емкостям и стерилизуют при 120 °C 20–30 мин

Агар Хоттингера готовят, добавляя к бульону Хоттингера 2% агар-агара.

Предприятия биологической промышленности выпускают готовые питательные бульоны и агар в виде сухого порошка.

Питательный бульон содержит (г/л): триптический гидролизат кильки — 10,05, хлорид натрия — 4,95. Навеску порошка массой 15 г растворяют в 1 л дистиллированной воды, кипятят 2 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по емкостям и стерилизуют в автоклаве при 120 °C 20 мин (рН 7,3).

Питательный агар содержит (г/л): ферментативный гидролизат кормовых дрожжей — 12,0; агар — 12,5; хлорид натрия — 5,5. Навеску порошка массой 36 г растворяют в 1 л дистиллированной воды, кипятят 3 мин, фильтруют через ватный фильтр, стерилизуют при температуре 120 °C 20 мин (рН 7,3).

Обогащенные среды. Многие виды болезнетворных бактерий плохо растут на общеупотребительных питательных средах, поэтому в основные среды добавляют кровь, сыворотку крови, углеводы и т. д. Такие питательные среды получили название обогащенных.

Сывороточный и кровяной агары: к расплавленному и охлажденному до 45–50 °С стерильному питательному агару добавляют 5–10% стерильной дефибринированной крови барана (кролика) или сыворотки крови (лошади, КРС, кролика). Для получения дефибринированной крови у барана кровь берут асептично из яремной вены стерильной иглой в стерильный флакон (или колбочку) со стеклянными (фарфоровыми) бусами или шариками, встряхивают вращательными движениями 15–20 мин, чтобы предотвратить свертывание крови. Фибрин остается на бусах. Компоненты перемешивают, разливают в чашки Петри, пробирки и оставляют до застывания питательной среды.

Сывороточный и кровяной бульоны готовят аналогичным образом.

Растворы углеродов (глюкоза и др.) стерилизуют текучим паром или фильтрованием и добавляют в количестве 0,5–1% к питательной среде.

Специальные среды. Так называют среды, разработанные с учетом специфических ростковых потребностей ряда бактерий. Например, желточная среда Мак-­Коя для возбудителя туляремии, среда Терских для культивирования лептоспир и др.

Среда Мак-­Коя: чистые куриные яйца обрабатывают спиртом, быстро проводят через пламя горелки. Стерильно вскрывают, желтки отделяют от белков. К 60 частям желтков добавляют 40 частей физиологического раствора (рН 7,0–7,2). Компоненты перемешивают, разливают в пробирки по 4–5 мл и помещают в наклонном положении в аппарат для свертывания сыворотки. Стерилизуют в первый день при 75 °C 1 ч, на второй день при 85 °C 30 мин Для контроля стерильности приготовленные среды выдерживают 2 сут в термостате при 37–38 °C.

Среда Терских состоит из фосфатной смеси Зеренсена и кроличьей сыворотки. Смесь Зеренсека: раствор А: гидрофосфат натрия — 11,876 г, вода дистиллированная — 1000 мл; раствор Б: дигидрофосфат калия — 9,078 г, вода дистиллированная — 1000 мл. К 90 мл раствора А добавляют 10 мл раствора Б и добавляют объем дистиллированной водой до 1000 мл. Раствор разливают в пробирки по 5 мл, стерилизуют при 1,5 атм. 20 мин В каждую пробирку добавляют шесть–восемь капель стерильной инактивированной при 56 °C сыворотки кролика.

Мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ) Китта-­Тароцци. Предварительно готовят печеночную воду: печень крупного рогатого скота промывают, очищают и нарезают мелкими кусочками, заливают водой 1:1, кипятят, фильтруют, стерилизуют. Полученную печеночную воду смешивают с МПБ 2:1 (на 2 л МПБ + 1 л печеночной воды). Кипятят, устанавливают рН, разливают по пробиркам (по 8–10 мл). Перед разливом среды в пробирки кладут кусочки вареной печени, сверху среду заливают 1–2 мл вазелинового масла, стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. 30 мин

Бульон и агар Мартена. Для приготовления сред Мартена используют продукты переварения свиных желудков (или сычуга рогатого скота). Желудки очищают от жира, фасций, измельчают в мясорубке и заливают водой 1:4 с добавлением к общему объему жидкости 1% соляной кислоты. Смесь выдерживают сутки при 50 °C, нейтрализуют 20%-ным раствором NaOH до щелочной реакции (посинение лакмусовой бумажки), автоклавируют при 120С 15 мин Затем смешивают равные количества полученного перевара и мясной воды, кипятят 10 мин, подщелачивают 20%-ным NaOH до рН 7,9, кипятят 30 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по пробиркам, колбам и автоклавируют при 0,5 атм. 30 мин Для приготовления плотной среды к полученному бульону Мартена добавляют 2–3% агара, определяют рН, фильтруют, как обычный МПА, стерилизуют при 0,5 атм. 30 мин

Элективные среды. От латинского Electus — избранный. Это питательные среды для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида из материалов, содержащих несколько видов микробов. Элективные среды чрезвычайно многообразно по своему составу. В них включают компоненты, обеспечивающие преимущественно рост искомого микроорганизма и (или) подавляющие в той или иной степени рост сопутствующей микрофлоры. По консистенции среды данного типа могут быть плотными и жидкими. Жидкие элективные среды называют средами обогащения или накопления, их применяют, когда ставят цель увеличить количество искомого микроорганизма в смешанной популяции.

Молочно-­солевой агар предназначен для избирательного культивирования стафилококков. К расплавленному МПА с рН 7,2–7,4, содержащему 5–7,5% хлорида натрия, добавляют 10% стерильного обезжиренного молока, перемешивают и разливают в чашки Петри.

Среда Шустовой предназначена для выделения сальмонелл. Представляет собой МПА (рН 7,4) с добавлением 10% к объему среды 50%-го водного раствора тиосульфата натрия и 2% раствора Люголя.

Среда Раппопорт предназначена для культивирования сальмонелл. К МПА добавляют 1% глюкозы, 10% желчи, 1% индикатора Андрэдэ. Стерилизуют текучим паром.

Среда Мюллера предназначена для культивирования сальмонелл. В колбу с 4,5 г стерильного мела наливают 90 мл МПБ, стерилизуют в автоклаве при 120 °C 30 мин Затем стерильно добавляют 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора тиосульфата натрия (тиосульфат натрия — 50 г, дистиллированная вода — 100 мл), стерилизуют в аппарате Коха 30 мин

Среда Кауфмана — это среда обогащения для сальмонелл. К 100 мл среды Мюллера добавляют 1 мл водного раствора бриллиантового зеленого, разведенного 1:1000, и 5 мл стерильной бычьей желчи. Смесь стерилизуют текучим паром 30 мин

Казеиново-­угольный агар (КУА) с пенициллином используют для культивирования бордетелл. К 1000 мл дистиллированной воды добавляют гидролизат казеина — 20 мл, хлорид натрия — 5 г, хлорид калия — 0,2 г, хлорид кальция — 0,002 г, карбонат натрия — 0,4 г, хлорид магния — 0,025 г, гидрофосфат калия — 0,24 г, растворимый крахмал — 1 г, цистин — 0,01 г, агар — 20 г. Компоненты растворяют, устанавливают рН 7,2, стерилизуют при 0,5 амт 30 мин Перед употреблением в расплавленный агар (50 °C) добавляют 3% дрожжевого экстракта и 0,2% сухого активированного угля и 0,5 ЕД/мл пенициллина. Компоненты перемешивают и разливают по чашкам Петри.

Дифференциально-­диагностические среды. Предназначены для выявления ферментов у микроорганизмов. По консистенции могут быть жидкими, полужидкими, плотными. В состав этих сред входят основная питательная среда, обеспечивающая рост изучаемого микроорганизма, субстрат для обнаружения фермента и индикатора, по изменению цвета которого судят о сдвиге рН среды в результате расщепления субстрата. К питательным средам такого типа относят среды Гисса, Эндо, Плоскирева, Левина и др.

Среду Гисса используют для изучения ферментативных свой­ств выделенных культур микроорганизмов. К 100 мл дистиллированной воды добавляют 1% пептона, 0,5 г хлорида натрия. Компоненты растворяют, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,0–7,4, добавляют один из углеводов-­субстратов (лактоза, глюкоза и т. д.), агар-агар (0,3–0,4%), а затем 1 мл индикатора Андрэдэ или 0,1 мл 1,6%-го раствора бромтимолового синего. Готовую среду разливают по 3 мл в пробирки, стерилизуют текучим паром три дня подряд по 30 мин или при 112 °C 20 мин Выпускают сухие среды Гисса с индикатором ВР — смесь водно-­голубого с розоловой кислотой (готовые среды — полужидкой консистенции).

Плотные дифференциально-­диагностические среды применяют для первичной изоляции возбудителей из материала. В их состав нередко кроме известного субстрата входят вещества, придающие питательной среде селективные свой­ства.

Среда Эндо содержит лактозу в качестве субстрата и предназначена для дифференциации бактерий, различающихся по способности расщеплять лактозу. К 1000 мл расплавленного МПА (рН 7,4) температурой 70 °C добавляют 1 г лактозы, предварительно растворенной в небольшом количестве дистиллированной кипяченной воды. В отдельных пробирках готовят: 2–3 мл спиртового раствора основного фуксина; 10 мл 10%-ного водного раствора сульфата натрия. В стерильную пробирку вносят 1 мл раствора фуксина и добавляют раствор сульфита натрия до обесцвечивания фуксина. Приготовленную смесь вливают в расплавленный агар, перемешивают и разливают по чашкам Петри. Готовая среда бесцветна, при росте на ней микроорганизмов, расщепляющих лактозу, среда закисляется, обесцвеченный фуксин восстанавливается, и колония микроорганизма, например эшерихий, приобретает красный цвет с металлическим оттенком. Среду готовят за сутки до ее использования. Выпускают также сухую среду Эндо. Перед употреблением определенную навеску порошка вносят в дистиллированную воду, кипятят и разливают по чашкам Петри.

Среда Левина. Аналогична по целевому назначению среде Эндо, но содержит другой индикатор (эозин с метиленовым синим). К 100 мл расплавленного МПА (рН 7,2–7,4) добавляют 2 мл 0,5%-ного водного раствора метиленового синего, 1,5 мл 2%-го раствора эозина желтого, 2 г лактозы, 0,2 дигидрофосфата калия. Растворы красителей готовят на дистиллированной воде, стерилизуют текучим паром 60 мин Лактозу и дигидрофосфат калия предварительно разводят в небольшом количестве стерильной дистиллированной воды и кипятят. Колонии лактозопозитивных бактерий на этой среде окрашены в фиолетово-­черный цвет.

Агар Плоскирева предназначен для выделения сальмонелл, содержит лактозу в качестве субстрата и компоненты, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры. Среду выпускают в виде порошка, в ее состав кроме питательной агаровой основы входят: желчные соли, цитрар натрия, тиосульфат натрия, фосфат натрия, бриллиантовый зеленый, кальцинированная сода, хлорид натрия, дактоза, нейтральный красный. Навеску порошка растворяют в воде, кипятят и разливают в чашки Петри. Готовая среда прозрачная или розовая. Колонии сальмонелл бесцветные, эшерихий — брусничного цвета.

Сухой висмут-­сульфит — агар: МПА, содержащий циртат висмута, сульфит натрия, дифосфат натрия, соль Мора, бриллиантовую зелень, глюкозу, кальцинированную соду. 6 г сухого вещества разводят в 100 мл дистиллированной воды, охлаждают до 50 °C, осторожно взбалтывают, разливают по чашкам Петри. Застывший агар подсушивают в термостате.

Молоко (обезжиренное) — естественная среда животного происхождения. Молоко слегка подщелачивают добавлением 1%-ной двууглекислой соды, проверяют реакцию лакмусовой бумажкой — легкое посинение ее свидетельствует о слабощелочной реакции молока. Фильтруют, разливают в стерильные пробирки, стерилизуют текучим паром дробно.

Растительные питательные среды. Готовят картофельные среды, морковные, гороховые, капустные и др.

Картофельные среды (ломтики или картофельная кашица). Вымытый картофель очищают от кожуры и глазков, нарезают ломтиками цилиндрической формы, затем их разрезают по диагонали на две части (чтобы была плоская поверхность для посева бактерий), погружают в 1%-ный раствор двууглекислой соды на 1–2 ч, затем просушивают фильтровальной бумагой и помещают в специальные пробирки с перетяжкой в ее нижней трети (пробирки Ру). На дно пробирки до перетяжки наливают 5%-ную глицеринизировнную воду. Стерилизуют при 120 °C 20 мин

Среды из кашицеобразного картофеля и из гороха наибольшее применение нашли в биологической промышленности. Процесс приготовления этих сред сложный, длительный. В диагностической бактериологической работе применяют очень редко.

Синтетические среды. Готовят из химически чистых, растворимых в воде веществ в строго определенных количествах — различных солей, углеводов, витаминов и др. Синтетические среды готовят жидкие, полужидкие и плотные.

Среда Ван-­Интерсона (для выращивания дрожжей и плесневых грибов) содержит азоткислый аммоний (NaH₄NO₃) — 0,5 г, калий фосфорнокислый однозамещенный (KH₂ PO₄) — 0,5 г, растворенные в 1 л водопроводной воды. Стерилизуют в автоклаве при 1 атм. 20 мин. Для культивирования грибов широко используют также глюкозный агар Сабуро (в 100 мл воды растворяют 4 г глюкозы, 1 г пептона, 1,8 г агара, автоклавируют при 0,5 атм. 20–30 мин) и агар Литмана (с бычьей желчью) — на 1 л воды — 10 г пептона, 10 г глюкозы, обезвоженной желчи крупного рогатого скота 15 мл, кристаллвиолета 0,01 г, агара 20 г. Стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °C 15 мин Разливают в чашки Петри толстым слоем.

1.4.4. Культивирование микроорганизмов

Микроорганизмы выращенные в лабораторных условиях, называют микробными культурами. Для получения культуры из исследуемого материала (кровь, эмульсия тканей, отечная жидкость, гной, молоко и др.) его высевают на стерильные питательные среды в пробирках, колбах или чашках Петри и помещают на определенное время в специальные шкафы — термостаты, где постоянно поддерживается необходимая температура. Температурный режим для разных групп микроорганизмов неодинаковый — 37–38, 26–30 и 22–25 °C. В условиях большого объема работы (биофабрики) имеются термостатные комнаты.

Выращивание микроорганизмов на естественных и искусственных питательных средах проводят по оптимальной температуре. Поддерживать постоянную температуру в течение длительного времени можно в специальных аппаратах — термостатах. Они могут быть водяного и воздушного обогрева. В современных термостатах источником энергии является электричество. Широкое распространение получили суховоздушные термостаты с теплорегулирующим устройством повышенной точности.

Культивирование анаэробов. Анаэробы растут без свободного кислорода воздуха, т. к. образующийся пероксид водорода (Н₂О₂) окисляет цитоплазму и вызывает гибель микробной клетки. Анаэробы не образуют каталазу, способную разрушать пероксид водорода. Создание условий с пониженным содержанием кислорода в воздухе окружающей среды достигается различными методами.

Физический метод. Анаэробиоз создается путем механического удаления воздуха с помощью вакуум-­масляного насоса. Эксикатор с посевами через манометр соединяют с насосом, с помощью которого отсасывают воздух. После закрытия крана и отсоединения эксикатора его вместе с посевами ставят в термостат для культивирования.

Химический метод. Основан на поглощении кислорода воздуха химическими веществами. Посевы с такими соединениями (пирогаллол и 10% раствор гидроксида натрия) помещают в герметически закрывающийся сосуд и ставят в термостат.

Биологический метод. Анаэробы и аэробы выращивают вместе. Для этого плотную питательную среду (МПА) в чашке Петри делят на 2 части, путем удаления узкой полоски среды. На одну из них высевают аэробы, на другую — анаэробы. После заливки краев чашки Петри парафином, ее ставят в термостат. Сначала вырастают аэробы, создающие благоприятные условия для развития анаэробов.

Комбинированный метод. Анаэробиоз создается путем одновременного или последовательного сочетания нескольких методов. Принцип этого метода основан на использовании среды Китта–Тароцци (МППБ). Среда представляет собой печеночный бульон, разбавленный трехкратным количеством мясопептонного бульона с кусочками мелко нарезанной печеночной, почечной или мышечной ткани. Сверху на среду наливают индифферентное вазелиновое масло. Для удаления газов, в том числе кислорода, среду перед применением нагревают до кипения на водяной бане.

Способы посева и пересева микроорганизмов на питательные среды

Микроорганизмы размножаются на питательных средах. Посев микробов осуществляют микробиологической петлей или иглой и пастеровскими пипетками. Пипетки перед применением стерилизуют в паровом стерилизаторе, тонкие концы их запаивают. Внутрь широкого конца пипетки, с которым соприкасаются губы исследователя, вставляют кусочек стерильной ваты, препятствующей попаданию материала в ротовую полость.

1.4.5. Техника посева

Петлю или пипетку держат в правой руке, пробирку — в левой. Пробирку мизинцем правой руки прижимают к ладони, и после извлечения держат в руке. Петлю вводят в пробирку, материал на плотной среде распределяют зигзагообразно, а в жидкой — вращательным движением. При пересеве из одной пробирки в другую петлю после введения внутрь охлаждают, затем берут культуру и извлекают из пробирки так, чтобы она не прошла над пламенем спиртовки.

Для посева уколом в пробирку с МПА столбиком необходимо иметь микробиологическую иглу, беспрепятственно проходящую в глубь питательной среды. На пути прохождения иглы остаются микробы, которые могут расти по уколу.

При посеве в бульонную культуру петлей касаются дна пробирки.

Пастеровскими пипетками берут жидкий материал или культуру, выращенную на жидкой питательной среде. Перед этим пипетку проводят над пламенем спиртовки, стерильным пинцетом отламывают запаянный конец, набирают материал и переносят на питательную среду. Пробирку закрывают над пламенем, а пипетку опускают в сосуд с дезинфицирующей жидкостью. На пробирках или чашках пишут дату, название органа или культуры, номер акта экспертизы, при проведении научных исследований делают другие пометки. Затем пробирки помещают в термостат для культивирования.

Для выделения чистой культуры из микробной смеси или материала готовят разведения на изотоническом растворе натрия хлорида и только после этого делают посев на плотную питательную среду в чашки Петри. Петлей или пипеткой на плотную питательную среду наносят каплю смеси, и легкими движениями шпателем распределяют ее по всей поверхности. Для того, чтобы получить изолированные колонии, внесенную каплю нужно распределить на поверхности среды в нескольких чашках, перенося шпатель из первой во вторую, из второй в третью и т. д.

Шпатель обычно изготавливают из стеклянной палочки в виде треугольника на одном конце, или из тонкой металлической проволоки. Предпочтительнее первый, так как при распределении смеси он легко скользит по поверхности среды. Крышку во время посева открывают по направлению к пламени спиртовки. После посева шпатель фламбируют и ставят в штатив. Чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат. В этом положении исключается возможность слияния колоний (при небольшом количестве они будут находиться на некотором расстоянии друг от друга, изолированно). Затем производят посев материала в пробирки на МПБ и МПА, а также смесь культур на МПА в чашки Петри.

В чашку Петри вносят питательную среду, для чего МПА столбиком расплавляют на водяной бане. Содержимое пробирок выливают в чашки Петри и над пламенем горелки плавными вращательными движениями равномерно распределяют по всей поверхности дна чашки.

Первый студент делает посев на одну чашку, которую со стороны дна делит на 3 сектора и соответственно обозначает цифрами I, II, III. В первый сектор петлей вносят каплю культуры, шпателем смесь сначала распределяют в одном секторе, затем переносят его во второй и третий сектора чашки. Второй студент делает посев на две чашки. Микробную смесь вносят в первую чашку и распределяют шпателем, затем этот же шпатель переносят во вторую чашку. Все чашки переворачивают вверх дном и ставят в термостат. Так можно получить изолированные колонии и выделить культуру в чистом виде.

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Приготовить основные (общеупотребительные) среды.

Задание 2. Приготовить растительные среды.

Задание 3. Провести пересев бульонной и агаровой культур бактерий на скошенный МПА и в МПБ в пробирках.

Задание 4. Провести посев смешанной бульонной культуры на МПА в чашках Петри по методу Дригальского.

Задание 5. Описать характер роста E. coli, S. aureus, B. cereus на МПА (колонии) и на МПБ.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. В чем отличие МПБ, бульона Мартена, бульона Хоттингера?

2. Назначение специальных, дифференциально-­диагностических и селективных питательных сред?

3. Что называют культурой микроорганизмов?

4. Что следует понимать под названием культивирование микроорганизмов?

5. Устройство и назначение термостата и терморегуляторов

6. Методы создания анаэробиоза.

7. Какие среды называются элпективными, их назначение и применение?

8. Какие существуют методы культивирования микроорганизмов?

9. Какова техника посева микробов на плотных, жидких и полужидких питательных средах?

Глава 1.5. Культуральные свой­ства микроорганизмов

1.5.1. Цель занятия

Ознакомить студентов с основными культуральными характеристиками микроорганизмов.

1.5.2. Материалы и оборудование

Бульонные и агаровые культуры B.cereus, E.coli и S.aureus в пробирках и чашках Петри.

1.5.3. Теоретический материал

Культуральные свой­ства микроорганизмов

В процессе идентификации наряду с другими свой­ствами у микроорганизмов изучают культуральные признаки — особенности роста на плотных, жидких и полужидких питательных средах при определенных условиях.

На плотных средах изучают колонии микроорганизмов. Бактерии каждого вида формируют колонии с определенными признаками, которые обычно учитывают при идентификации.

Размер колоний: крупные — диаметром 4–6 мм и более, средние — 2–4 мм, мелкие — 1–2 мм и точечные колонии диаметром менее 1 мм.

Форма колоний может быть правильной круглой, неправильной (амебовидной, розеткообразной), корневидной.

Цвет зависит от способности микроорганизма образовывать пигмент: белый, желтый, красный, сине-зеленый и т. д. Бактерии, не синтезирующие пигмент, формируют бесцветные колонии.

Характер поверхности, которая может быть шероховатой, блестящей, матовой, сухой, влажной, гладкой, радиально или концентрически исчерченной.

Края колонии могут быть ровными, волнистыми, зазубренными, бахромчатыми, их исследуют невооруженным глазом и под малым увеличением микроскопа.

Рельеф (профиль) определяют, рассматривая колонию сбоку; различают плоские, конусообразные, куполообразные, плоские с конусовидным центром или углублением в центре колонии, с утолщенными (валикообразными) краями.

Прозрачность колонии: непрозрачная, полупрозрачная, прозрачная.

Структура может быть однородной, зернистой, волокнистой и т. д. Ее выявляют при слабом увеличении микроскопа.

Консистенция может быть пастообразной, слизистой, плотной (сухой) и т. д.; ее определяют, дотрагиваясь до колонии бактериологической петлей. Колонии некоторых видов врастают в толщу питательной среды, что также определяют при помощи бактериологической петли.

Запах: многие виды бактерий в процессе роста на питательных средах выделяют специфические ароматические вещества.

Ценную дополнительную информацию об особенностях строения колоний дает их изучение в косопадающем пучке света. Культуры на прозрачной агаровой среде в чашках Петри помещают на предметный столик бинокулярной лупы. Между бинокулярной стеклой и источником света помещают зеркало от микроскопа вогнутой стороной вверх таким образом, чтобы лучи, отраженные от него, попадали в плоскость изучаемого объекта под углом 40–45°. Зеркало устанавливают на равном удалении от объекта и источника света (12–14 см). При таком освещении колонии бактерий могут быть окрашены в различные цвета. Цвет зависит как от видовых особенностей, так и от состояния культуры (S-, R-формы).

На жидких средах учитывают следующие признаки:

Степень помутнения среды — интенсивное, среднее, слабое.

Наличие или отсутствие пристеночного кольца на границе мениска и внутренней поверхности пробирки.

Характер поверхностной пленки — толщина, цвет, поверхность.

Характер осадка — обильный, скудный, компактный, хлопьевидный, слизистый. При характеристике осадка пробирку слегка встряхивают и учитывают результат: осадок разбивается в гомогенную равномерную суспензию; образуется мелкие или крупные хлопья, глыбки; слизистый осадок при встряхивании обычно поднимается в виде косички. Пигментообразующие микроорганизмы вызывают окрашивание питательной среды и осадка (желтое, зеленоватое, красное и т. д.).

На полужидких питательных средах изучают отношение микробов к кислороду:

Аэробы — рост в виде «перевернутой елочки».

Анаэробы — рост в виде «нормальной елочки».

Факультативные — рост в виде «ершика».

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Изучить культуральные свой­ства микроорганизмов на агаровых культурах в чашках Петри.

Задание 2. Определить культуральные признаки на жидких питательных средах.

Задание 3. Ознакомиться с культуральными свой­ствами на МПЖ и определить аэробиоз.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Какие культуральные признаки учитывают при идентификации бактерий?

2. Что такое колония микробов?

3. Каковы культуральные свой­ства микроорганизмов на плотных питательных средах?

4. По каким признакам исследуют культуральные свой­ства микроорганизмов на жидких питательных средах?

5. Каковы особенности культуральных свой­ств микроорганизмов на полужидких питательных средах?

6. Какие существуют методы культивирования анаэробных форм микроорганимов?